اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS

اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS نیازمند دقتی است که به عوامل متعددی بستگی دارد که در این مقاله به شش مورد از آنها اشاره کرده‌ایم. همراه آذین باشید…

نکات مهم اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV-VIS

علاوه بر نحوه عملکرد دستگاه اسپکتروفتومتر، بیشترین میزان خطای دستگاه اسپکتروفتومتر مربوط به جابجایی نمونه است. عواملی مانند حلال، pH محلول، دما، غلظت بالای الکترولیت و مواد تداخل کننده طیف جذب ماده را تحت تاثیر قرار می‌دهد. اثرات این متغیرها باید شناسایی شده و شرایط مناسبی برای بررسی و آنالیز مهیا گردد تا تغییرات کوچک و کنترل نشده در اندازه آنها منجر به تغییر در میزان جذب نشود. مهمترین اثرات این متغیرها در بخش‌های زیر شرح داده شده است:

1) اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV-VIS بر اساس کووت

اولین معیار مهم اندازه گیری دقیق نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS، تعیین اساس کووت می‌باشد. کووت مورد استفاده، برای اندازه گیری نمونه بخشی از سیستم نوری اسپکتروفتومتر به شمار می‌رود. موقعیت و شکل هندسی کووت بر میزان دقت اندازه گیری جذب تاثیر می‌گذارد؛ بنابراین کووت باید به دقت کنترل شود.

به منظور اندازه گیری بهینه نمو.نه در طول اندازه گیری اسپکتروفتومتر UV/VIS، کووت باید در داخل نگهدارنده باقی بماند. اگر کووت در داخل نگهدارنده جابجا شود باید فوراً با دقت مجدداً در مسیر نور تنظیم گردد. این امر یکسان بودن اثرات نوری در مرجع و نمونه را تصدیق می‌کند.

علاوه بر این، به منظور دستیابی به نتایج بهتر در اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS، یک نوع کووت برای اندازه گیری بهینه مرجع و نمونه به کار می‌رود. در ناحیه طیفی مورد نظر، کووت‌ها دارای روزنه‌هایی از جنس مواد شفاف می‌باشند. برای دستیابی به نتایج دقیق اندازه گیری در محدوده UV، در روزنه کووت از شیشه های شفاف UV مانند شیشه کوارتز یا شیشه سوپراسیل استفاده می‌شود. کووت های یکبار مصرف از جنس پلی متیل متاکریلات، در محدوده فرابنفش جذب شده و مانند یک فیلتر برش عمل می‌کند. این کووت‌ها در محدوده UV داده‌های نادرستی را در اختیار می‌گذارند؛ بنابراین کووت‌های یکبار مصرف فقط برای اندازه گیری در ناحیه مرئی قابل استفاده می‌باشند.

• سل کوارتز مدل ۵۰Q-1
• سل کوارتز optical مدل ۱۰Q-1
• سل کوارتز ۱۰ سانت مدل ۱۰۰Q-1
• سل کوارتز اسپکتروفتومتر

در سیستم های نوری مانند اسپکتروسکوپی UV-Vis تمیز بودن کووت تاثیر بسزایی بر نتایج اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS می‌گذارد. روزنه های کووت که نور از آن‌ها عبور می‌کند باید قبل از هر بار استفاده با دستمال‌های بدون پرز (برای جلوگیری از خراشیدگی سطح) تمیز شوند. اگر رسوباتی مانند اثر انگشت یا گریس به دلیل وجود اجزای جاذب اضافی بر روی روزنه های کووت باقی بماند، مقادیر جذب بیشتر خواهد شد. برای جلوگیری از آن، روزنه های کووت قبل و بعد از استفاده باید به دقت تمیز شوند. پس از اتمام تمیز کاری از لمس کردن روزنه‌ها خودداری کنید.

سرانجام ذرات شناور در سلول‌ها، پرتو نور را از مسیر خود منحرف کرده و منجر به جذب زمینه‌ای می‌شود. این نوع بازتاب نور را “پراکندگی نور” می‌نامند.

• بخوانید: اسپکتروفتومتر UV/VIS چیست و چه کاربردی دارد

2) اندازه گیری بر حسب انتخاب حلال

دومین عامل تاثیرگذار در اندازه گیری نمونه ها در اسپکتروفتومتر UV/VIS، انتخاب حلال آن نمونه می‌باشد. حلال مورد استفاده در اسپکتروسکوپی UV/VIS باید در سرتاسر محدوده موردنظر شفاف باشد و همچنین مقادیر کافی از نمونه را در خود حل کرده و قله مشخصی را نمایان سازد. هر حلال طول موج قطع جداگانه‌ای برای جذب UV-VIS دارد. در طول موج قطع و پایین‌تر از آن، حلال مورد نظر تمامی نور ساطع شده را جذب می‌نماید؛ بنابراین در انتخاب حلال، آگاهی از طول موج قطع جذب و همچنین میزان جذب ترکیب مورد آزمایش بسیار حائز اهمیت است. در صورتیکه این دو مقادیر نزدیک بهم باشند، باید حلال متفاوتی انتخاب شود.

باید در نظر داشته باشید که در طول موج های کمتر از 300nm میزان جذب حلال بسیار بالاست؛ در نتیجه در این طول موج ها، جذب افزایشی نمونه مورد آزمایش در مقایسه با جذب کلّی کمتر است. حلال‌های رایج و محدوده طول موج آنها در جدول زیر ارائه شده است که همانطور که گقته شد در محاسبه و اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS تاثیر مهمی از خود نشان می‌دهند.

به طور کلی، حلال‌ ها و مولکول‌ های غیرقطبی کمترین تاثیر را بر یکدیگر می‌گذارند. با این وجود، در برهم کنش مولکول های قطبی با یک حلال قطبی مانند آب، در استرهای الکل و کتون ها تغییرات شدیدی ایجاد می‌شود. برهم کنش املاح و حلال منجر به افزایش نوار جذب و در نتیجه کاهش رزولوشن ساختاری و ماکزیمم ضریب جذب می‌شود. این برهم‌ کنش‌ ها ممکن است ساختارهای ارتعاشی را از بین ببرند؛ بنابراین در صورت نیاز به جزئیات طیفی بیشتر باید از این بر هم کنش ها اجتناب کرد.

شکل زیر اثر ایزواکتان و اتانول بر طیف فنل را نمایش می‌دهد. با تغییر از حلال غیرقطبی (ایزواکتان) به حلال قطبی (اتانول)، ریزساختارها به دلیل ارتعاشات فنل تضعیف می‌شوند. بطور کلی طیف‌های ثبت‌شده در حلال های غیرقطبی مشابه طیف های بدست آمده از نمونه‌های گازی هستند.

شکل 1: طیف های فنل در حلال های ایزواکتان و اتانول. حلال‌های قطبی مانند اتانول رزولوشن طیفی بسیار پایینی را نشان می‌دهد.

برخی از محصولات اسپکتروفتومتر در شرکت آذین:

اسپکتروفتومتر UV-Vis مدل AE-S60-4UPC کمپانی ae

اسپکتروفتومتر UNICO مدل Vis 2150

اسپکتروفتومتر دو پرتویی EU2800DA کمپانی ONLAB

3) اندازه گیری نمونه اسپکتروفتومتر UV-VIS بر اساس غلظت نمونه

غلظت نمونه از عوامل دیگر تاثیرگذار در اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS به حساب می‌آید. برای دستیابی به نتایج بهینه اندازه گیری و مطابقت آن با قانون بیر لمبرت، میزان جذب باید در محدوده خطی دستگاه مشخص گردد. بنابراین از مقادیر جذب بسیار زیاد (2.5AU <) و بسیار کم (0.3AU >) خودداری کنید، زیرا ممکن است منجر به ایجاد حالت غیرخطی شود.

با این وجود، برخلاف سایر تکنیک‌های تحلیلی، نمونه‌هایی با غلظت پایین مانند 0.01mol/L را می‌توان با استفاده از اسپکتروفتومتر UV/VIS اندازه گیری کرد. رایج ترین مثال در این زمینه، تجزیه تحلیل آب می‌باشد که در آن غلظت‌های بسیار کم نیز تعیین می‌گردد.

زمانیکه یک آنالیت با حلال واکنش دهد (ارتباط، تفکیک) گونه‌های شیمیایی جدیدی ایجاد می‌شود. این گونه‌ها میزان جذب را در نمونه تغییر می‌دهند. برای جلوگیری از هرگونه واکنش جانبی استفاده از یک حلال غیر تعاملی و آنالیتی با غلظت کم توصیه می‌گردد.

• بخوانید: آموزش نصب و راه اندازی دستگاه اسپکتروفتومتر

4) اندازه گیری در اسپکتروفتومتر UV/VIS با توجه به انتخاب طول موج

چهارمین نکته در محاسبه و اندازه گیری دقیق نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS، توجه به طول موج نمونه می‌باشد. برای دستیابی به حداکثر میزان حساسیت، میزان جذب در طول موج پیک مربوطه با استفاده از روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری می‌شود. میزان اهمیت اندازه گیری دقیق جذب uv/vis در طول موج ماکزیمم لاندا در شکل زیر نشان داده شده است. تنظیم طول موج نوارهای باریک قله، تاثیر قابل توجهی بر میزان جذب قله نخواهد گذاشت. در صورتیکه نواری با عرض یکسان به طول موج کوتاه‌تر انتقال یابد، با توجه به موقعیت مطلق نواری که در آن اندازه گیری انجام می‌پذیرد، احتمال خطا در اندازه گیری نمونه اسپکتروفتومتر UV/VIS وجود دارد؛ هنگامیکه داده‌ها در طول موج ماکزیمم جذب اندازه گیری شوند، خطاهای ناشی از تنظیم طول موج یا کالیبراسیون دستگاه به حداقل می‌رسد.

شکل 2: نمودار چپ: تغییر میزان جذب با تغییر طول موج آن، تاثیر قابل توجهی بر نوار B دارد؛ در حالیکه در نوار A این تاثیر بسیار اندک و قابل چشم‌پوشی است.

نمودار راست: این تغییرات، غلظت محاسبه شده یک نمونه در نوار B را تحت تاثیر قرار می‌دهد.

5) اندازه گیری نمونه اسپکتروفتومتر UV-VIS بر مبنای آنالیز مخلوط ها

آنالیز مخلوط ها نیز یکی دیگر از عوامل مهم در دقت اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS محسوب می‌شود که باید به آن توجه کرد. میزان جذب کل یک محلول در هر طول موج معادل مجموع جذب اجزای جداگانه در محلول است. این نسبت در اصل غلظت اجزای جداگانه یک مخلوط را حتی اگر در طیف آنها همپوشانی کامل برقرار باشد، تعیین می‌کند. برای آنالیز مخلوط، ابتدا ضرایب جذب مولار اجزا جداگانه مخلوط در طول موج های مشخص، تعیین می‌گردد. به طور مطلوب، طول موج ها باید به نحوی انتخاب شوند که ضرایب جذب اجزاء مخلوط کاملاً متفاوت با یکدیگر باشند.

برای مثال، در یک مخلوط دو جزئی، ضریب جذب جزء A در طول موج λ1 بسیار بیشتر از ضریب جذب جزء B در طول موج λ1 است. در طول موج دوم λ2، این نسبت برعکس می‌باشد. غلظت های استاندارد جزء A و B باید از قانون بیر لمبرت پیروی کرده و شامل یک محدوده جذب ویژه برای مخلوط نمونه باشند.

برای تکمیل آنالیز، مخلوط مورد نظر در طول موج های λ1 و λ2 اندازه گیری می‌شود. میزان غلظت با استفاده از مقادیر جذب، ضرایب جذب و طول مسیر مورد استفاده محاسبه می‌گردد.

• بخوانید: ۱۱ نکته مهم استفاده از اسپکتروفتومتر

6) اسپکتروسکوپی UV/VIS بر اساس میکروحجم

آخرین موردی که در دقت اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر های UV/VIS اهمیت دارد، توجه به میکروحجم نمونه هاست. در یک پلتفرم میکروحجم، نمونه‌هایی با حجم بسیار کم مانند میکرولیتر قابل اندازه‌گیری هستند. نمونه‌هایی با غلظت بالا به دلیل در دسترس بودن طول در 0.1mm یا 1mm به آسانی و بدون نیاز به رقیق سازی اندازه‌گیری می‌شوند. این روش در وهله اول برای اندازه گیری نمونه های DNA و پروتئین به کار می‌رود.

به منظور جلوگیری از تداخل در اندازه‌گیری، توصیه می‌شود قبل از اندازه‌گیری، صفحه موردنظر را با dH₂O تمیز کنید. از اسپری کردن آب یا مایع دیگر بر سطح دستگاه اسپکتروفتومتر خودداری کنید.

توصیه‌های اضافی جهت پاکسازی سطح دستگاه به شرح زیر است:

• توصیه می شود جهت اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS، مابین اندازه گیری ها، بقایای نمونه را با استفاده از یک دستمال آزمایشگاهی تمیز، خشک و بدون پرز از پلت فرم های بالا و پایین دستگاه پاک سازی کنید.
• پس از اتمام اندازه گیری نمونه‌ ها در محدوده اسپکتروفتومتر UV/VIS، هر دو سطح میکروحجم را با استفاده از dH₂O ضدعفونی کنید. با توجه به نوع نمونه می‌توان از محلول 60% ایزوپروپانول، اتانول یا آب خالص نیز برای تمیز کردن سطح میکروحجم استفاده کرد. در صورت لزوم، از یک حلال برای حل کردن نمونه باقیمانده بر روی دستگاه استفاده می‌شود. در صورتیکه نمونه بر روی سطح میکرو حجم خشک شود، می‌توان بااستفاده از 3μL از 0.5MHCL سطح دستگاه را پاکسازی کرد. پس از استعمال سایر محلول‌های تمیزکننده، سرانجام سطح دستگاه با استفاده از 3μL dH₂O تمیز می‌شود.
• در صورت استفاده از مواد شوینده یا ایزوپروپیل الکل 100%، پاکسازی با 3μL dH₂O آخرین مرحله پاکسازی سطح میکروحجم می‌باشد.
• سطح صیقلی دستگاه استفاده از قطرات محلول های آبی در زاویه تماس زیاد را ممکن می‌سازد. اگر قطره صاف شود بعد از بستن بازوی میکروحجم، اندازه گیری نمونه‌ در محدوده اسپکتروفتومتر UV/VIS  از طریق هوا انجام می‌پذیرد. این روش اندازه گیری نتایج اشتباهی را ارائه می‌دهد که در تصاویر زیر قابل مشاهده است.

شکل 3: قطره غیرمسطح (شکل سمت چپ) و قطره مسطح (شکل سمت راست)

• برای سم زدایی سطح میکروحجم، محلولی مانند 0.5% هیپوکلریت سدیم (محلول سفید کننده رقیق شده تجاری 1.10) مورد استفاده قرار گرفته و پاکسازی ثانویه با آب دی یونیزه انجام می‌پذیرد.

***

در این مقاله آموزشی شما را با 6 نکته مهم در اندازه گیری نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS آشنا کردیم. سوالات مروبط به این مقاله را می‌توانید در قسمت کامنت‌ها برایمان بنویسید تا در سریعترین زمان به شما پاسخ دهیم. آذین تجهیز بعنوان نمایندگی فروش اسپکتروفتومتر UV و UV/VIS در ایران از کمپانی‌های HACH ،UNICO ،AE ،METAHS ،ONLAB و … فعالیت می‌کند. لازم به ذکر است فروش این دستگاه با یکسال ضمانت و 10 سال خدمات پس از فروش همراه است. جهت خرید اسپکتروفتومتر تک پرتویی و دو پرتویی یا دریافت مشاوره رایگان با شماره‌های 02166578892 و 02166572995 تماس حاصل نمایید.