اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه چیست

در این مقاله به اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه می‌پردازیم. چنانچه علاقمند به این موضوع هستید تا انتهای این مقاله ما را همراهی کنید …

اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه

چرا طیف‌های UV/VIS اندازه گیری می‌شوند؟

پنج دلیل عمده برای اندازه گیری طیف UV/VIS وجود دارد:

• دلیل اول) اجزاء مختلف محلول نمونه با استفاده از طیف UV/VIS شناسایی می‌شوند. به بیان دقیق‌تر، موقعیت و شکل پیک جذب برای شناسایی ترکیبات ویژه بکار می‌روند؛ به‌عنوان مثال، ترکیبات آلی توسط طیف‌ها شناسایی شده و درصد خلوص حلال نیز به روش اسپکتروفتومتر UV/VIS مورد محاسبه قرار می‌گیرد.
• از مقادیر پیک‌های جذب می‌توان برای تعیین کمیت نمونه مورد آزمایش استفاده کرد؛ به‌عنوان مثال غلظت نمونه با استفاده از عدد جذب پیک محاسبه می‌گردد:

• دلیل دوم) براساس رابطه جذب و غلظت نمونه، اسپکتروفتومتر UV/VIS به‌عنوان یک روش تحلیلی در بخش‌های مختلف مارکتینگ مانند آزمایش آب، صنایع غذایی و آشامیدنی، صنعت دارو، شیمی و بیوتکنولوژی کاربرد دارد.
• دلیل سوم) موقعیت پیک‌ها در طیف، ساختار مولکولی نمونه را آشکار می‌سازد؛ برای مثال گروه‌های یک ساختار مولکولیِ خاص مانند کربن – اکسیژن (C=O)، یا پیوندهای دو گانه ی کربن – کربن (C=C) در طول موج‌های مشخص جذب می‌شوند.
• دلیل چهارم) طیف، خصوصیات فیزیکی مولکول‌های نمونه را نمایان می‌سازد؛ برای مثال ضریب جذب نمونه و نقطه ذوب پروتئین‌ها و نوکلئیک اسیدها با استفاده از طیف‌های UV/VIS محاسبه می‌شود. با کنترل طیف جذبی به‌عنوان تابعی از زمان، سرعت وقوع واکنش‌ها نیز تعیین می‌شود. (اندازه گیری انرژی جنبشی)
• دلیل پنجم) سرانجام با توجه به موقعیت و شکل منحنی پیک‌ها در طیف، اطلاعات بسیاری راجع به محیط میکروسکوپی مولکول‌های نمونه به‌دست می‌آید؛ برای مثال وجود ناخالصی‌ها یا حضور سایر حلال‌ها در محلول نمونه، بر موقعیت و شکل منحنی پیک‌ها تأثیر می‌گذارند. به عبارت دیگر، پیک‌ها ممکن است به دلیل وجود ناخالصی، عریض‌تر شده یا تغییر موقعیت دهند.

کاربرد اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه عمدتاً بر بررسی‌های کمی و کیفی متمرکز شده است.

مطالب مرتبط:

• اسپکتروفتومتر UV/VIS چیست و چه کاربردی دارد

• ۶ نکته مهم  اندازه گیری دقیق نمونه در اسپکتروفتومتر UV/VIS

آنالیز کیفی: شناسایی

در آنالیز کمی درصورتی که آنالیت (Analyte) خالص و تجزیه نشده باشد، می‌توان از اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه برای شناسایی استفاده کرد. این روش برای کنترل کیفیت مواد اولیه و بررسی میزان خلوص ترکیبات بیولوژیکی مانند اسیدهای نوکلئیک، DNA و RNA به کار می‌رود.

علاوه بر این، نقطه ذوب DNA را می‌توان با ثبت طیف‌های UV/VIS در دماهای مختلف تعیین کرد. اسپکتروسکوپی UV/VIS برای تفکیک اسیدهای چرب اشباع شده و اشباع نشده در روغن زیتون بکار می‌رود. در نتیجه این روش در کنترل کیفیت روغن زیتون نقش بسزایی دارد.

آنالیز کیفی براساس ویژگی‌های اسپکتروفتومتر UV/VIS انجام می‌پذیرد. در اصل نمونه‌ها نور چند طول موج مشخص را با حداکثر میزان جذب، جذب می‌نمایند. هر نمونه دارای طیف UV/VIS مشخص و منحصر به فردی است به همین دلیل از این طیف‌ها می‌توان برای شناسایی نمونه استفاده کرد. به طور اختصاصی، شناسایی نمونه از طریق مقایسه طیف نمونه با طیف ترکیبات خالص و مشخص انجام می‌پذیرد.

نمونه‌ای از طیف UV/VIS کلروفیل a را در شکل زیر می‌بینید. این مولکول، مسئول رنگ سبز برگ‌ها و چمن‌ها است. این مولکول‌ها دارای نوارهای جذب قوی در ناحیه بنفش، آبی و قرمزِ طیف UV/VIS خود می‌باشند.

تابعی از طول موج طیف جذبی بتاکاروتن (β-Carotene) نیز به عنوان مثال دوم اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه ارائه شده است. بتاکاروتن یک رنگدانه طبیعی به رنگ نارنجی مایل به قرمز است که در گیاهان و میوه هایی مانند هویج، کدو تنبل و سیب زمینی شیرین به وفور یافت می شود و با یک نوار جذب قوی در ناحیه آبی-بنفش طیف مشخص می گردد. طبق USP، محلول نمونه اولین پیک جذب را در طول موج 427nm، ماکزیمم جذب در طول موج 455nm و آخرین پیک جذب را در محدوده طول موج 483nm نشان می دهد. نسبت جذب 455 و 483 (یعنی A(483)/A(455)nm) ، در محدوده 1.18 و 1.14 قرار دارد. نوارهای جذب و نسبت A(483)/A(455) امکان شناسایی دقیق بتاکاروتن موجود در محلول نمونه را فراهم می کند. جذب در این طول موج ها باعث میشود نمونه حاوی بتاکاروتن به رنگ نارنجی مایل به قرمز دیده شود.

طیف UV/VIS سه ترکیب مختلف در شکل زیر آورده شده است. هر سه ترکیب به دلیل ساختارهای شیمیایی متفاوت، دارای طیف های منحصر به فردی می‌باشند که این امر، اساس تشخیص و شناسایی نمونه در روش اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه است!

• بخوانید: شرایط و نکات طلایی استفاده از اسپکتروفتومتر

آنالیز کمی: تعیین غلظت

بر اساس قانون بیر لمبرت (Beer Lambert law: A=ƐbC) ، غلظت کمی یک ترکیب در محلول را می‌توان از طریق اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه تعیین کرد. برای انجام این کار ابتدا یک خط کالیبراسیون با اندازه‌گیری میزان جذب چندین محلول استاندارد با غلظت مشخص، تعیین می‌شود. به این ترتیب غلظت نمونه‌هایی مانند DNA ،RNA، پروتئین ها، کربوهیدرات‌ها یا ترکیبات آلی اندازه گیری می‌شود.

رابطه خطی میزان جذب و غلظت نمونه، زمینه را برای آنالیز کمی فراهم می‌سازد. در جدول زیر سه کاربرد اصلی قانون بیر لمبرت ارائه شده است:

برخی از محصولات اسپکتروفتومتر:

اسپکتروفتومتر UNICO مدل Vis 2150

اسپکتروفتومتر UNICO مدل Vis 2100 PC

اسپکتروفتومتر UNICO مدل Vis 2100

خط کالیبراسیون با اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه

برای تعیین غلظت محلول نمونه ناشناخته توسط اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه، ابتدا باید یک خط کالیبراسیون ایجاد شود. این کار با اندازه‌گیری میزان جذب نور چندین محلول استاندارد با غلظت های مختلف و معین در طول موج ثابت و از پیش تعیین شده انجام می‌پذیرد. در مثال زیر، میزان افزایش غلظت پنج محلول استاندارد در طول موج معین، اندازه گیری شده است:

یک خط کالیبراسیون با ثبت مقادیر جذب، بعنوان تابعی از غلظت رسم شده است. در نهایت رگرسیون خطی مقادیر اندازه‌گیری شده، خط کالیبراسیون را نمایش می‌دهد:

• بخوانید: دستورالعمل فنی دستگاه اسپکتروفتومتر | راهنمای اسپکتروفتومتر

تعیین نمونه

اکنون با به کارگیری خط کالیبراسیون، یک نمونه ناشناخته را می‌توان با استفاده از مقدار جذب آن شناسایی کرد:

طرح دستگاه اسپکتروفتومتر چگونه است

دستگاه اسپکتروفتومتر (spectrophotometer) از چهار جزء تشکیل شده است:

1. یک منبع نور مناسب، طیف UV/VIS مورد نظر را تأمین می‌کند. این منبع به‌طور کلی از یک لامپ حاوی گاز (مانند گاز زنون یا ترکیبی از دو لامپ مختلف مانند تنگستن/دوتریم) تشکیل شده است.
2. برای ثابت نگه داشتن نمونه، از یک نگهدارنده سمپل استفاده می‌شود.

̵  نمونه‌های مایع در کووتی از جنس کوارتز، شیشه بوروسیلیکات یا پلاستیک آکریلیک قرار می‌گیرند. شیشه و پلاستیک آکریلیک، نور فرابنفش را از خود عبور نمی‌دهند، بنابراین دو نوع کووت فقط برای اندازه گیری در محدوده نور مرئی بکار می‌روند.

̵  نمونه های جامد توسط نگهدارنده مناسب در مسیر نوری اسپکتروفتومتر (اسپکتروسکوپی) بصورت ثابت قرار می گیرند تا میزان نور عبوری از نمونه اندازه‌گیری شود.

3. یک عنصر پراکندگی برای تقسیم نور به طول موج‌های جداگانه مورد نیاز است. این جزء ممکن است منشور کوارتز یا شبکه پراش باشد؛ به‌عنوان مثال یک جزء نوری با ساختار دوره‌ای می‌تواند نور را پراش دهد.
4. سرانجام شدت نور عبوری توسط دیتکتور مناسب مانند دستگاه شیدافزار نوری، ارائه چند کاناله (فوتودیود یا PDA) یا یک دستگاه بار جفت شده (CCD) که مشابه دوربین دیجیتال است ثبت می‌گردد. دیتکتورهای PDA و CCD از یک ماده نیمه رسانای حساس به نور برای تبدیل نور به یک سیگنال الکترومغناطیسی استفاده می‌کنند. این سیگنال‌ها متعاقباً توسط دستگاه ضبط می‌شود.

اسپکتروفتومترهای UV/VIS را می توان طبق شکل هندسی اجزا سازنده سیستم نوری برای ثبت طیف ها طبقه بندی کرد. بطور کلی در اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه دو ترکیب زیر کاربرد دارند:

• اسپکتروفتومتر اسکن
• اسپکتروفتومتر ارائه

• بخوانید: اسپکتروفتومتری چیست | کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر

دستگاه اسپکتروفتومتر اسکن چگونه کار می‌کند

اصول کار اسپکتروفتومتر اسکن معمولی بر اساس اندازه‌گیری مقدار عبور نور در طول موج‌های خاص است که این دستگاه را به عنوان اولین ترکیب از اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه میشناسند. نحوه کار با این دستگاه نیز به این صورت است که نور ابتدا با استفاده از توری بازتاب در طول موج‌های جداگانه پراکنده می‌شود. توری بازتاب به منظور انتخاب طول موج مورد نظر چرخانده شده، سپس طول موج انتخابی از طریق یک کووت ارسال می‌شود. نور عبوری در طول موج مورد نظر ثبت می‌گردد و با تغییر مداوم طول موج نور ورودی (اسکن) به محلول نمونه به‌وسیله چرخش توری کل طیف به‌دست می‌آید:

توجه داشته باشید که مدتی زمان می‌برد تا اسپکتروفتومتر اسکن، طیف را به‌طور کامل اسکن نماید؛ زیرا برای این کار، توری بازتاب باید توسط یک موتور بصورت مکانیکی چرخانده شود. روند اسکن با توجه به سرعت اسکن اسپکتروسکوپی، ممکن است منجر به کاهش دقت و قابلیت تکرارپذیری انتخاب طول موج شود.

اسپکتروفتومتر ارائه چیست

اسپکتروفتومتر ارائه دومین ترکیبی است که به عنوان اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این پیکربندی، نمونه توسط پرتو نور متشکل از تمام اجزا طیفی در محدوده UV/VIS (پیوستار) روشن می‌گردد. به عبارت دیگر، نمونه موجود در کووت به‌طور همزمان طول موج‌های مختلف نور را جذب می‌کند. همانطور که در نمودار زیر نشان داده شده است، نور عبوری توسط یک توری بازتاب که متعاقباً بعد از کووت نصب شده است، پراکنده می‌شود.

این طرح با عنوان “اپتیک معکوس” نیز شناخته می شود؛ زیرا نور فقط پس از عبور از نمونه، توسط توری شکسته می‌شود! نور مربوط به طول موج های مختلف به سمت دیتکتور هدایت می‌شود. دیتکتور با ارائه حساس به نور و مواد نیمه رسانا، امکان اندازه‌گیری همزمان تمام طول موج های پرتوی نور را فراهم می‌سازد.

بطور کلی سرعت اندازه‌گیری کل طیف UV/VIS در این طرح بیشتر از سرعت اندازه‌گیری اسپکتروفتومتر اسکن است؛ زیرا طیف بطور همزمان در تمام طول موج‌ها ثبت می‌شود. علاوه بر این، دیتکتور ارائه دارای یک تابع انتگرال است که اندازه‌های جداگانه را برای افزایش سیگنال جمع آوری می‌کند. این امر نسبت سیگنال به صدا را افزایش می‌دهد و در نتیجه منجر به بهبود کیفیت اندازه‌گیری طیف میشود.

مسیر نوری

اسپکتروفتومترهای UV/VIS ممکن است دارای یک مسیر تک پرتو یا دو پرتو باشند. مسیری که پرتو نور از لامپ ساطع شده و برای رسیدن به دیتکتور از کووت نمونه عبور می‌کند.

• پیکربندی تک پرتو

پیکربندی تک پرتو، ساده‌ترین و آسان‌ترین نوع تنظیمات را در اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه داراست. پرتو نور مستقیماً از نمونه به دیتکتور هدایت می‌شود. به منظور تعیین نمونه شاهد، ابتدا کووت حاوی محلول به‌طور جداگانه اندازه گیری می‌شود. پس از اندازه گیری نمونه شاهد، کووت محلول با یک کووت حاوی نمونه موردنظر جایگزین می‌گردد و در نهایت میزان جذب طیف نمونه مورد نظر اندازه‌گیری می‌شود.

• پیکربندی دو پرتو

در یک پیکربندی دو پرتو، پرتو نور به دو پرتو مرجع و نمونه تقسیم می‌شود. دو گزینه انتخابی برای مسیر نوری موجود است.

̵  همزمان

پرتو نوری که از لامپ ساطع می‌شود، به دو پرتو با شدت نور برابر تقسیم می‌شود. هر پرتو از یک کووت متفاوت عبور می‌کند. کووت مرجع فقط با حلال پر شده و کووت دوم حاوی محلول نمونه است. شدت هر دو پرتو به‌طور همزمان توسط دو دیتکتور مجزا اندازه‌گیری می‌شود.

̵  تناوبی

این پیکربندی با هدایت مسیر نور با یک برشگر نوری (OC) که آینه چرخان است حاصل می‌شود. نور به طور متناوب از یک نمونه و سلول مرجع هدایت می‌شود. یک دیتکتور اختصاصی هر دو پرتو نور را یکی پس از دیگری اندازه گیری می‌کند.

• بخوانید: آموزش نصب و راه‌اندازی اسپکتروفتومتر | راهنمای استفاده اسپکتروفتومتر

اسپکتروسکوپی UV/VIS بر اساس کووت

متلر تولدو (Mettler Toledo)، اسپکتروفتومتر ارائه تک پرتو را ایجاد کرد تا امکان اندازه گیری دقیق و سریع در محدوده UV/VIS فراهم شود. اختراع او در استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه نقش ویژه‌ای داشت! در این دستگاه، منبع نور شامل یک لامپ زنون برای ساطع کردن اشعه فرابنفش (UV)، نور مرئی (VIS) و بخشی از طول موج‌های ناحیه نزدیک فروسرخ (محدوده طیفی 190 تا 1100nm) می‌باشد. فلاش‌های لامپ بر روی یک پشم شیشه که پرتو نور را به یک کووت حاوی محلول نمونه هدایت می‌کند متمرکز شده است و پرتو نوری که از یک نمونه و طول موج‌های مختلف عبور می‌کند، توسط اجزای نمونه جذب می‌شود.

نور باقیمانده پس از عبور از کووت توسط پشم شیشه جمع آوری شده و به درون یک طیف نگار هدایت می‌شود. طیف نگار از یک توری پراش و یک حسگر CCD تشکیل شده است. توری پراش برای جداسازی نور به طول موج های مختلف و حسگر CCD برای ثبت طیف ها بکار می‌رود. بنابراین کل طیف بطور همزمان اندازه‌گیری شده و این امر منجر به تسریع در عملیات ثبت طیف می‌شود.

اسپکتروفتومتر UV/VIS میکرو حجم

متلر تولدو دستگاه اسپکتروفتومتری را که قادر به اندازه‌گیری میکرو حجم UV/VIS است اختراع کرد که این دستگاه در شاخه ی استفاده از اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه کاربرد قابل توجهی داشت! این ابزار قادر به اندازه‌گیری نمونه‌هایی با حجم‌های بسیار کوچک و غلظت‌های بسیار بالا می‌باشد. استفاده از این روش بسیار ساده است؛ بطوریکه نمونه بدون نیاز به رقیق سازی بیشتر، مستقیماً بر روی سکوی اندازه‌گیری پیپت می‌شود؛ بنابراین از خطای دستی نیز اجتناب می‌شود. علاوه بر این، انتخاب مسیر خاص اندازه‌گیریِ نمونه‌هایی با حجم کمتر از دامنه‌ی غلظتِ بسیار بالا را ممکن می‌سازد.

اندازه‌گیری‌ها در سکویی با حجم بسیار کوچک انجام می‌پذیرد. این سکو توسط یک بازوی متحرک که در قسمت بالای دستگاه نصب شده است محفاظت میشود. اسپکتروفتومتر دارای یک سکوی میکرو حجم و یک نگهدارنده کووت می‌باشد. با توجه به نوع برنامه کاربردی انتخاب شده، نور بر روی سکوی میکرو حجم یا کووت یک سانتیمتری هدایت می‌شود، سپس نور عبوری بر روی توری پراش متمرکز می‌شود. درنهایت پرتوهای نور پراش یافته با طول موج‌های مختلف به سمت دیتکتور هدایت می‌شوند.

زمانی که بازو در موقعیت باز قرار دارد، می‌توان به‌راحتی با استفاده از یک پیپت از سمت چپ یا راست به سکوی میکرو حجم دسترسی پیدا کرد. خمیدگی درب بالایی ابزار، این امکان را برای اپراتور فراهم می‌سازد تا به راحتی بتواند نوک پیپت را به‌طور ایمن هدایت کند. در طول اندازه‌گیری، بازوی دستگاه به‌طور ایمن در یک مسیر مشخص قفل شده است و تا زمانی که اندازه‌گیری به پایان نرسیده، قفل باز نمی‌شود!

شکل 15: اسپکتروفتومتر میکرو حجم ارائه: سمپل با استفاده از یک پیپت به سکوی میکرو حجم اضافه می‌شود؛ سپس بازوی متحرک به منظور اندازه‌گیری، بسته می‌شود.

***

در این مقاله سعی کردیم شما را با اسپکتروفتومتر UV/VIS در شیمی تجزیه و جزئیات مربوط به آن آشنا کنیم. چنانچه سوال یا ابهامی در این زمینه داشتید می‌توانید در زیر همین نوشته و از قسمت نظرات آنرا مطرح بفرمایید. لازم به ذکر است شرکت تجهیزات آزمایشگاهی آذین با واردات و فروش انواع اسپکتروفتومتر از کمپانی‌های مطرح دنیا از جمله کمپانی های HACH، UNICO METASH ،ONLAB، AE و … نیاز جامعه آزمایشگاهی کشور را از این نظر تامین نموده است. جهت خرید این دستگاه با 1 سال ضمانت و 10 سال خدمات پس از فروش با شماره‌های 0216657892 و 02166572995 تماس حاصل نمایید.